Test Genetici


Test Genetici

I Test Genetici sono una conquista recente della Medicina, ancora in fase sviluppo e di miglioramento. La decodifica del Dna ha posto le basi della Medicina Predittiva. Questa branca della Medicina Moderna permette di avere informazioni che possono aiutare a determinare la predisposizione genetica per alcune malattie e fornire indicazioni per prevenirle.

Con “test genetico” si intende l’analisi del DNA, l’RNA, cromosomi o di specifici geni, del loro prodotto o della loro funzione, nonché ogni altro tipo di indagine finalizzata a individuare o a escludere mutazioni associate a malattie genetiche. Rispetto ad altri esami di laboratorio, i test genetici presentano alcune specificità, in quanto i risultati possono coinvolgere non solo la singola persona, ma anche i membri della famiglia.

Tipi di Test

1Test di Genetica molecolare

I test di Genetica Molecolare studiano la struttura e la funzione del DNA, dei suoi prodotti (RNA e proteine) correlando le modificazioni con specifiche malattie. Trovano particolare applicazione nelle patologie genetiche causate da mutazioni in un singolo gene(Malattie monogeniche o monofattoriali)

Gli esami sono eseguiti presso il Laboratorio di Genetica Medica TECNOBIOS PRENATALE EUROGENLAB S.r.l. di Bologna

2Test diagnostici

consentono di effettuare una diagnosi o di confermare un sospetto clinico di malattia genetica. Possono essere eseguiti in epoca prenatale o nel corso della vita.

Esistono centinaia di test per la diagnosi di molte patologie ereditarie. Molti di questi test ricercano alterazioni in geni specifici responsabili di patologie, come per esempio la Fibrosi Cistica, l’Anemia Falciforme o la Distrofia Muscolare di Duchenne. Molte patologie ereditarie possono essere identificate indirettamente tramite la rilevazione di anomalie nei prodotti finali ( come proteine o metaboliti ) di geni che potrebbero essere alterati. Un esempio è l’emofilia, una sindrome emorragica, in cui lo screening rileva la diminuzione di alcune proteine che regolano la coagulazione del sangue.

I test genetici forniscono inoltre indicazioni utili per la ricerca della stessa mutazione nei familiari dell'individuo affetto.

3Test di Identificazione dei Portatori Sani

permettono di effettuare indagini sui familiari di soggetti affetti da patologie genetiche più o meno rare. Tali tipi di test consentono la verifica dello stato di portatore e nel contempo di rilevare la presenza di una variante genetica che potrebbe essere trasmessa ai figli ed essere causa di malattia nel caso in cui questa variante, o una simile, sia presente anche nel partner. Questo tipo di test può essere offerto alle coppie che progettano una gravidanza e che hanno una storia familiare positiva per patologie autosomico recessive, come la Fibrosi Cistica o l’Anemia Mediterranea. Un portatore di una malattia autosomica recessiva è solitamente asintomatico, oppure presenta sintomi lievi. Tuttavia, nel caso in cui i suoi figli ereditino due copie del gene mutato, una da ciascun genitore, è possibile che la malattia si manifesti.

4Test Preclinici o Presintomatici

permettono di individuare il gene responsabile di malattie genetiche, i cui sintomi non sono presenti alla nascita, ma compaiono successivamente, anche in età avanzata. Questi test sono di solito usati per la diagnosi di patologie a esordio tardivo (Malattia di Huntington, Distrofia Miotonica di Steinert, Emocromatosi Ereditaria) in persone con anamnesi familiare positiva per questo tipo di patologie.

• Screening Neonatale Esteso: non è propriamente un test genetico, ma un programma di Medicina Preventiva Pubblica eseguito su tutti i neonati, indirizzato alla ricerca di 40 malattie genetiche ereditarie. Si effettua su poche gocce di sangue prelevate dal tallone del bimbo. Se lo screening risulta positivo, il bimbo può essere richiamato per un approfondimento che confermi il sospetto clinico, anche attraverso test genetici diagnostici.

• Test Genetici Prenatali: forniscono informazioni riguardo alla possibilità che un feto sia affetto da malattie genetiche. Spesso questi test ricercano la presenza di alterazioni del numero normale di cromosomi (aneuploidie). I test di screening prenatali eseguiti su sangue materno sono indicati durante il primo e il secondo trimestre di gravidanza. I Test di screening non sono diagnostici e pertanto possono richiedere ulteriori approfondimenti: un risultato positivo a un test di screening deve comunque essere confermato tramite l'analisi diretta del materiale di origine fetale raccolto tramite l'amniocentesi o la villocentesi.

• Test di Suscettibilità: consentono di individuare varianti genetiche che di per sé non causano una malattia, ma comportano un aumento del rischio di svilupparla, in seguito all’esposizione a fattori ambientali favorenti o alla presenza di altri fattori genetici scatenanti. Rientra in questo ambito la maggior parte delle malattie multifattoriali dell’adulto, dal cancro al diabete. Il risultato di questo tipo di test genetico può solo predire un maggiore rischio di sviluppare una malattia. L’identificazione di persone non affette, ma ad alto rischio genetico, può determinare l’attivazione di misure preventive, che variano in base alla patologia.

I Test di Paternità e di Identificazione per la Genetica Forense, ricadono nella grande famiglia dei test genetici in quanto utilizzano strumenti e procedure simili, ma non vanno confusi con i test precedenti.

I test genetici richiedono sempre Consulenza Genetica

I TEST


1Test di paternità

Aspetti generali
Il test di paternità consente di stabilire se un uomo è o non è il padre biologico di una persona.
Questa verifica si può effettuare poichè ciascuno di noi eredita una metà del proprio patrimonio genetico dal padre e l’altra metà dalla madre, dal confronto di determinate caratteristiche genetiche del figlio, oggetto di indagine di paternità, con quelle del presunto padre e della madre è possibile stabilire l’attribuzione di paternità o l’esclusione di paternità. Il padre presunto, per essere considerato padre biologico, dovrà possedere metà del profilo genetico presente nel figlio o figlia.
Attualmente l’esame viene eseguito mediante l’analisi di regioni del DNA molto variabili, cioè diverse per lunghezza da individuo a individuo, definite microsatelliti (STR) .

Esempi di test di paternità
Nella Fig.1 per semplicità sono considerati solo cinque microsatelliti (normalmente si analizzano 9-15 STR) di lunghezza variabile indicata con una lettera (lettere diverse per lunghezze diverse); in ogni individuo, un microsatellite, come un gene, è presente in duplice copia. Il profilo del presunto padre è A/B-C/D-E/F-G/G-H/I, quello della madre D/B-J/E-F/K-L/M-N/G; il figlio che ha ereditato metà del patrimonio genetico dal padre e metà dalla madre ha un profilo B/D-D/J-F/F-G/L-I/N. Questo risultato suggerisce con una probabilità del 99,99% che il padre presunto è il padre biologico (attribuzione di paternità).

Fig.1 – Attribuzione di paternità
Nella Fig.2 il profilo del presunto padre è A/B-C/D-E/F-G/G-H/I, quello della madre D/B-J/E-F/K-L/M-N/G; il figlio ha un profilo genetico C/D-K/J-G/F-P/L-E/N, cioè differisce dal padre per tutti gli STR; questo risultato indica che il padre presunto non è il padre biologico (esclusione di paternità).

Fig.2- Esclusione di paternità
Normalmente il test viene eseguito confrontando il profilo genetico di tre soggetti: presunto padre, figlio e madre; se non vi è disponibilità della madre può essere condotto anche solo su figlio e presunto padre.
Il test può essere richiesto da una persona o coppia per verificare la paternità biologica, sia per puri fini informativi, per ragioni di affidamento o di mantenimento di un minore

Tipi di test di paternità
• Test di paternità informativo
• Test di paternità legale
• Test Paternità Prenatale Non Invasivo

Test di paternità informativo
Nel test di paternità informativo viene fatta compilare una scheda in cui il laboratorio, viene autorizzato ad eseguire il test, dopo i soggetti interessati sono stati informati sulla finalità del test.
Il laboratorio di riferimento è inoltre liberato da qualsiasi responsabilità derivante da azioni o comportamenti non idonei dei soggetti interessati. Tempi di risposta
I risultati del test di paternità sono disponibili mediamente dopo 10-15 giorni dal prelievo.

Materiale analizzato
Il test è eseguito su DNA estratto da linfociti di sangue periferico (prelievo venoso in provette con EDTA) o da cellule della mucosa buccale mediante cytobrush (indicato per neonati o bambini). Il test può essere eseguito anche su materiale biologico alternativo (capelli con radice, lametta da barba, liquido seminale, chewing-gum,…) ma non viene assicurato il successo a causa della qualità, non sempre ottimale, del DNA estratto.

Test di paternità legale
Affinché il test di paternità abbia validità legale occorrono:
– documento di riconoscimento valido (carta d’identità, passaporto, patente, ecc.) dei soggetti che si sottopongono all’analisi
– per i minori o persone soggette a tutela è necessaria l’autorizzazione di colui/coloro che ha/hanno la patria potestà o la tutela legale
– per gli adulti, consenso firmato sulle modalità e finalità del prelievo e dell’analisi
Non è necessario il prelievo simultaneo per tutti gli individui coinvolti.

Tempi di risposta
I risultati del test di paternità sono disponibili mediamente dopo 60 giorni dal prelievo

Materiale analizzato
Il test è eseguito su DNA estratto da linfociti di sangue periferico (prelievo venoso in provette con EDTA) o da cellule della mucosa buccale mediante cytobrush (indicato per neonati o bambini).

Test di paternità prenatale non invasivo
Aspetti generali
Il test di paternità prenatale non invasivo può determinare in maniera rigorosa la paternità ancor prima che il bambino nasca. Il test di paternità prenatale non-invasivo, offre risultati con massima accuratezza ed è sicuro per madre e bambino. Eseguito solo al DDC (DNA Diagnostics Centre, Fairfield, Ohio, U.S.A.), è il più accurato metodo non invasivo disponibile in Italia per determinare la paternità del bambino prima della sua nascita. Questa procedura avanzata sfrutta la tecnologia del DNA SNP microarray per individuare ed analizzare il DNA del bambino che si trova nel circolo ematico della madre.
Accuratezza dei Test del DNA e Probabilità
Nell’ambito dei test di paternità, i termini accuratezza e probabilità sono spesso confusi.
• L’accuratezza è una misura dell’esattezza del test. È anche un riflesso della qualità dei processi del test e del personale.
• La probabilità indica quanto sia verosimile la parentela biologica testata.

Accuratezza
Il test genetico effettuato dal DNA Diagnostics Centre è accurato al 100% perché:
• Il test del DNA viene eseguito due volte. Due gruppi processano indipendentemente i campioni per ogni caso e confrontano i loro risultati per assicurare che siano gli stessi. Questo riduce la possibilità di errori che possono portare a false esclusioni, come quelli causati da scambio di campioni o contaminazione, che possono portare a false esclusioni.
• Il laboratorio che analizza il campione è costituito da tecnici competenti.
• Quando è necessario si effettuano analisi più estese. Nei casi in cui è necessario, il laboratorio esamina marcatori del DNA addizionali per assicurare un risultato accurato. Questi test estesi sono utili quando si incontrano situazioni difficili come ad esempio mutazioni genetiche.
• Stato dell’arte del laboratorio. Il laboratorio è equipaggiato con le più recenti innovazioni della tecnologia dei test del DNA. Termociclatori per PCR, sistemi di robotica e analizzatori genetici riducono il potenziale errore umano, aiutando a garantire l’accuratezza dei nostri risultati.

Probabilità
Quando si ricevono i risultati del test di paternità, si otterrà di fatto una Probabilità di Paternità. Questo valore indica con quale probabilità il presunto padre è il padre biologico del bambino.
• Una Probabilità di Paternità del 99% o superiore indica che il presunto padre testato non può essere escluso dall’essere il padre biologico del bambino. Per il test di paternità del DDC, abitualmente si raggiungono probabilità ben al di sopra del 99,99%.
• Una Probabilità di Paternità dello 0% indica che il presunto padre non è il padre biologico del bambino.

Note:
Quando un presunto padre non è escluso in quanto padre biologico, la Probabilità di Paternità sarà sempre del 99% o superiore (spesso 99,99% o superiore). Questa percentuale si basa su calcoli che sono eseguiti usando una banca dati della popolazione per determinare la probabilità di parentela. Non potrà mai essere garantita una probabilità del 100%. Per farlo sarebbe necessario esaminare ed escludere ogni altro uomo del mondo. I risultati degli altri test di parentela presenteranno simili probabilità. Un test dei nonni, per esempio, mostrerà una Probabilità di Parentela dei Nonni. Un test di maternità mostrerà una Probabilità di Maternità. Si possono leggere questi numeri nello stesso descritto sopra. In conclusione, quando i risultati del test hanno un valore di probabilità del 99% (o maggiore) o dello 0%, si può essere certi che i risultati del test sono accurati del 100%.

Quando e come eseguire il test
Il test può essere eseguito a partire dalla 8° settimana compiuta di gravidanza (per la datazione corretta si consiglia di eseguire un’ecografia prima del test). Richiede solo un prelievo venoso dalla madre (il DNA del bambino si trova nel sangue della madre) e un campione biologico (sangue o cellule della mucosa orale prelevate con un semplice tampone di cotone a secco) per il presunto padre. Il test è validato solo per gravidanze singole. Su richiesta può essere determinato anche il sesso del feto.

Tempi di risposta
Il risultato del test è disponibile dopo 20 giorni lavorativi dal prelievo.
2Trombofilia ereditaria

Trombofilia ereditaria (fattori della coagulazione)

Fig.1 – Formazione di un trombo sulla parete di un vaso sanguigno
Aspetti generali
La Tombofilia Ereditaria è una condizione genetica che determina un maggior rischio di trombosi. Questo perché il sangue è meno fluido, può coagularsi (trombo) in un vaso sanguigno e aderendo alla parete ostruisce in modo completo o parziale il flusso del sangue; pertanto i tessuti, non ricevendo più sangue e nutrimento, subiscono dei danni. La predisposizione ereditaria alla Trombofilia è particolarmente importante in gravidanza perché può portare ad aborti ripetuti, distacco della placenta. Sono stati identificati diversi geni le cui varianti sono responsabili di una maggiore coagulabilità del sangue. Essere portatori di una o più mutazioni in questi geni aumenta notevolmente il rischio di trombosi. La manifestazione clinica più frequente è la trombosi venosa. Inoltre, ci sono condizioni, come la gravidanza, uso di contraccettivi orali(pillola), interventi chirurgici, che determinano un incrementato rischio di trombosi. .

Aspetti genetici
I geni che sembrano maggiormente coinvolti nel conferire suscettibilità (predisposizione) ad eventi trombotici sono quelli che codificano per alcuni fattori delle coagulazione, quali Fattore V di Leiden, Fattore II (Protrombina), l’enzima Metilentetraidrofolatoreduttasi (gene MTHFR), PAI 1. Nella popolazione la maggior parte dei difetti della coagulazione si presenta in forma eterozigote, cioè i soggetti sono portatori di una mutazione in una delle due copie del gene; essi hanno una possibilità su due di trasmettere la predisposizione alla malattia ai figli, indipendentemente dal sesso. Gli individui in cui sono alterate entrambe le copie del gene sono definiti omozigoti, mentre i soggetti nei quali è alterata una sola copia del gene sono indicati come eterozigoti. L’analisi del DNA permette di identificare gli individui portatori di una specifica mutazione, sia in eterozigosi che in omozigosi.

 FATTORE V
Il Fattore V è una proteina molto importante nel promuovere il processo di coagulazione del sangue. Nei soggetti non portatori di mutazione genetica tale evento è regolato ed avviene correttamente. La presenza della mutazione R506Q o G1691A o Arg506Gln, definita variante di Leiden, comporta, invece, una maggiore attività pro-coagulativa del Fattore V con conseguente aumento del rischio di sviluppare una trombosi venosa. Per i soggetti eterozigoti (genotipo GA),che costituiscono complessivamente il 3-8% della popolazione (2-3% in Italia), il rischio è superiore di 5-10 volte. Negli omozigoti, genotipo AA, la cui frequenza è di 1 soggetto su 5000, tuttavia varia notevolmente tra le diverse popolazioni, il rischio è pari a 50-100 volte. Il rischio di un evento trombotico aumenta ulteriormente in presenza di altre condizioni predisponenti quali la gravidanza (fino a 50 volte), l’assunzione di contraccettivi orali (30 volte negli eterozigoti e centinaia di volte negli omozigoti), gli interventi chirurgici.

 FATTORE II (PROTROMBINA)
La Protrombina o Fattore Il della Coagulazione svolge ruolo fondamentale nella coagulazione, in quanto la sua attivazione, ad opera del Fattore V, porta alla formazione di trombina; la trombina determina la conversione del fibrinogeno in fibrina e, quindi, la formazione del coagulo. L’analisi del DNA per il Fattore II permette di identificare la mutazione G20210A, che causa un innalzamento dei livelli di protrombina (120-140%), e quindi di trombina nel plasma con aumentato rischio di trombosi, soprattutto venosa. I soggetti eterozigoti(portatori di una sola copia della variante) hanno una frequenza nella popolazione del 2-3% e un rischio aumentato di 2-3 volte rispetto alla media. L’evento trombotico è favorito anche in presenza di altre condizioni quali l’assunzione di contraccettivi orali (da 15 a 30 volte). I soggetti omozigoti per la mutazione sono invece rari. La compresenza della mutazione FV Leiden aumenta il rischio di trombosi di 100 volte.

 METILENTETRAIDROFOLATOREDUTTASI (MTHFR)
La metilentetraidrofolatoreduttasi (MTHFR) è una proteina che, a differenza dei fattori II e V, non è direttamente coinvolta nel processo di coagulazione del sangue, ma è importante in diverse reazioni metaboliche tra cui la trasformazione dell’omocisteina nell’aminoacido metionina. Dal punto di vista genetico, la mutazione nel gene MTHFR, indicata come C677T, determina, specialmente negli omozigoti una riduzione dell’attività della proteina del 50% che è meno efficiente nel convertire l’omocisteina in metionina. Questa condizione comporta un aumento dei livelli di omocisteina nel sangue (omocisteinemia) e nelle urine (omocisteinuria). Livelli plasmatici elevati di omocisteina sono considerati fattore di rischio per lo sviluppo di una trombosi. Nella popolazione la frequenza degli eterozigoti (genotipo CT) per la mutazione C677T è circa il 45%, quella degli omozigoti (genotipo TT) è di poco superiore al 10%. Recenti studi indicano che i soggetti omozigoti per la mutazione hanno un rischio di trombosi venosa più alto del 20% rispetto agli omozigoti normali. Nelle donne in gravidanza queste varianti sono associate ad un rischio aumentato di aborto e difetti del tubo neurale Nel gene MTHFR vi è un’altra mutazione, nota come A1298C, che causa una riduzione dell’attività enzimatica del 30% se presente singolarmente( non sembra però influenzare i livelli di omocisteina nel plasma) e del 60% negli eterozigoti composti C677T/A1298C che hanno, invece, valori plasmatici elevati di omocisteina. Nei soggetti in cui la mutazione C677T in eterozigosi è associata alla variante di Leiden (Fattore V) o alla G20210A (Fattore II), può aumentare ulteriormente il rischio di eventi trombotici, già alto per la presenza dell’altra mutazione.

• PAI-1
L’Inibitore dell’Attivatore del Plasminogeno di tipo 1 (PAI-1) contribuisce alla formazione del trombo, elevati livelli di PAI-1 nel plasma sono associati ad un aumento del rischio di insorgenza di eventi trombotici per la persistenza del coagulo. Nel gene PAI-1 è stato individuato un polimorfismo, noto come 4G/5G (inserzione/delezione G-675), che influenza i livelli di proteina PAI-1 nel sangue. Gli individui omozigoti(genotipo5G/5G), che costituiscono circa il 25% della popolazione, hanno valori plasmatici normali di PAI 1; i soggetti eterozigoti (genotipo 4G/5G) , che rappresentano il 50% della popolazione, e gli omozigoti (genotipo 4G/4G, che sono il 25% della popolazione ) presentano livelli plasmatici di PAI-1 superiori. Numerosi studi hanno dimostrato che gli omozigoti 4G/4G hanno valori più elevati di oltre il 25% di proteina PAI-1 nel plasma, rispetto ai soggetti 5G/5G. In generale la presenza dell’allele 4G, sia in omozigosi sia in eterozigosi, sembra essere correlato con un aumento del rischio di un evento trombotico, e nelle donne in gravidanza a distacco della placenta e parto prematuro. Gli effetti del genotipo 4G/4G aumentano se associati alla variante R506Q del Fattore V di Leiden, alla variante G20210A nel fattore II o al polimorfismo C677T nel gene MTHFR.

Consulenza genetica
La Consulenza Genetica fornisce ai pazienti e i loro familiari, in termini comprensibili, informazioni sul rischio di trasmissione della malattia all’interno della famiglia, sulle possibilità di diagnosi e trattamento.

Tempi di risposta
Il risultato del test sul DNA è generalmente disponibile dopo 15 giorni dal prelievo.

Materiale analizzato
DNA estratto da linfociti di sangue periferico mediante prelievo venoso raccolto in provette con EDTA.
Fonti bibliografiche e sitografiche
Malattie genetiche – Cao, Dalla Piccola, Notarangelo – Piccin (2004)
Rosendaal FR, Reitsma PH (2009). Genetics of VT- J. Thromb. Haemost. 7 Suppl 1: 301–4
Rosedaal FR (2005) Venous Thrombosis: The Role of Genes, Environment, and Behavior -Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program
http://www.orpha.net
3Beta-Thalassemia

Aspetti clinici

Le Talassemie sono un gruppo di malattie ereditarie del sangue, caratterizzate da un'anemia cronica dovuta alla sintesi ridotta (variante+) o assente (variante°) di una o più delle catene globiniche (a, b e d) presenti nella molecola dell’emoglobina (Hb) umana, ovvero la proteina localizzata nei globuli rossi del sangue in grado di trasportare l’ossigeno attraverso l’organismo. Le Talassemie sono malattie monogeniche (l’insorgenza della malattia è legata all’alterazione di un singolo gene e si presentano come patologie con ereditarietà familiare).

Esistono diverse forme: quella più diffusa nel bacino del Mediterraneo è la Beta-Talassemia (dovuta a ridotta o totale assenza delle sintesi di catene beta dell'emoglobina). L’espressione clinica di tale emoglobinopatia, in soggetti omozigoti (entrambi alleli mutati per medesima mutazione) ed eterozigoti composti si manifesta con anemia causata dalla distruzione nel midollo osseo dei precursori dei globuli rossi. I primi sintomi della malattia sono rilevabili già a sei mesi dalla nascita con ingrossamento del fegato e milza (epatosplenomegalia) e alterazioni ossee. I bimbi affetti presentano, oltre i segni clinici di anemia grave, ritardo nella crescita, stanchezza e pallore. La conferma diagnostica si ottiene tramite analisi cliniche e biochimiche, sulla quantità e il tipo di catene globiniche presenti nel sangue (esame emocromocitometrico ed elettroforesi dell’emoglobina), accompagnate, poi, da test genetici.

L’unica terapia risolutiva per la Beta-Talassemia è il trapianto di midollo osseo o di cellule staminali da donatori compatibili, che nell’80-90% dei casi porta a guarigione. Una soluzione temporanea per il trattamento della Beta-Talassemia consiste in trasfusioni periodiche, ogni 15-20 giorni, le quali permettono di eliminare il ferro accumulatosi.

L’incidenza della Beta-Talassemia è equivalente all’1,5% della popolazione mondiale con circa 90.000 portatori sani (ovvero non presentano i sintomi della malattia) e 400.000 affetti entrambi distribuiti nelle aree geografiche precedentemente interessate da casi malarici (l’eterozigosità risulta essere un fattore protettivo per l’infezione da Plasmodium falciparum) come bacino Mediterraneo, Medio Oriente, Sud-Est Asiatico ed Estremo Oriente. In Italia si contano circa 5-6.000 malati di cui 1.000 nella sola Sardegna. Il nome “talassemia” deriva dal greco “thàlassa” (mare) e “haîma” (sangue), ed è stato scelto per via della grande diffusione di questa patologia nell’area del bacino del Mediterraneo. La malattia era tipicamente presente tra le popolazioni residenti nelle aree paludose o acquitrinose, infestate per secoli dalla malaria: la ragione di ciò risiede nel fatto che, nei talassemici o nei portatori di trait talassemico, l'anomalia dei globuli rossi ostacola la riproduzione del plasmodio della malaria, rendendoli più resistenti a questa malattia e consentendo, negli anni, una sorta di selezione naturale.

Aspetti genetici

La beta talassemia si trasmette con modalità autosomica recessiva: in una coppia di genitori, entrambi portatori di mutazione nel gene beta globinico, ogni figlio avrà il 25% di probabilità di essere sano, il 25% di probabilità di essere malato e il 50% di probabilità di essere portatore della malattia. Un portatore sano, pur essendo clinicamente asintomatico, presenterà una riduzione del volume dei globuli rossi, dell’emoglobina media e un aumento dell’HbA2 (componente minore dell’emoglobina umana). Le alterazioni a carico del gene beta-globinico, responsabili dell’insorgenza della Beta-Talassemia, si identificano con mutazioni puntiformi (sostituzione, inserimento o perdita di un nucleotide, ovvero l’unità fondamentale della molecola di DNA) o delezioni grossolane (perdita di un maggior numero di nucleotidi) ed entrambe le tipologie mutazionali coinvolgono diversi livelli di espressione del suddetto gene. Conoscendo le mutazioni presenti nei genitori, è possibile effettuare una diagnosi prenatale mediante villocentesi

Test genetico

Il test eseguito nel nostro Laboratorio di riferimento permette di identificare le 25 principali mutazioni del gene della beta-globina, responsabili della beta°(assenza delle catene beta) e beta+(riduzione delle catene beta)
Tempi di risposta
Il risultato delle analisi è disponibile dopo 10 giorni lavorativi dal prelievo ematico
Materiale analizzato
DNA estratto da linfociti di sangue periferico (in provetta con EDTA) mediante prelievo venoso o da cellule della mucosa orale prelevate mediante tampone di cotone a secco.

Bibliografia
 Cao A, Dallapiccola B, Notarangelo LD, Malattie Genetiche-Diagnosi, Prevenzione e Terapia;Piccin, 2004
 Sardegna Salute, Incidenza della talassemia, in www.sardegnasalute.it, 2019

4Fibrosi cistica o Mucoviscidosi

Aspetti clinici
La Fibrosi Cistica o Mucoviscidosi è una malattia genetica, cronica, evolutiva e colpisce un neonato ogni 2500-2700 nati vivi. Nei pazienti affetti da fibrosi cistica le secrezioni delle ghiandole esocrine, cioè i liquidi biologici come muco, sudore, saliva, sperma, i succhi gastrici, sono molto più dense e viscose del normale. Le manifestazioni più frequenti (Fig.1) sono a carico dell’apparato respiratorio (bronchite cronica), del pancreas (problemi digestivi), più raramente dell’intestino (ostruzione stercorale), del fegato (cirrosi) e dell’apparato riproduttivo (infertilità, soprattutto maschile). Le secrezioni anomale provocano un danno progressivo agli organi coinvolti. La malattia si manifesta per lo più entro i primi anni di vita, talora più tardivamente, e può esprimersi con maggiore o minore gravità in individui diversi. Il trattamento è esclusivamente sintomatico e consiste nel posizionamento di un drenaggio bronchiale, nella somministrazione di antibiotici per le infezioni respiratorie, negli esami per valutare la funzionalità del pancreas, nella somministrazione di vitamine e integratori energetici per i problemi digestivi e nutrizionali. Il decorso e la prognosi della Fibrosi Cistica sono notevolmente migliorati negli ultimi decenni, soprattutto per i pazienti diagnosticati precocemente. Esistono anche forme atipiche della malattia, caratterizzate da sufficienza pancreatica e problemi respiratori modesti. Talvolta la patologia può interessare quasi esclusivamente un unico organo come nel caso dell’infertilità maschile oppure manifestarsi, in entrambi i sessi, con episodi di pancreatite ricorrente.

Aspetti genetici
La Fibrosi Cistica è una malattia monogenica che si trasmette con modalità autosomica recessiva, determinata da mutazioni, cioè alterazioni del DNA, che insorgono nel gene, chiamato CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). La Fibrosi Cistica è determinata da alterazioni a livello di una coppia di geni, i geni sono costituiti da DNA e sono ereditati in coppie, derivando uno dal padre ed uno dalla madre. La Fibrosi Cistica si definisce autosomica recessiva perché si manifesta solo negli individui in cui entrambe le copie del gene sono alterate e non dipende dal sesso dell’individuo. Gli individui, invece, che possiedono una sola copia del gene alterato e una copia normale sono asintomatici e si definiscono “portatori sani” o “eterozigoti” per la mutazione. La frequenza dei portatori sani di Fibrosi Cistica nella popolazione generale è di circa 1 su 25 individui. Il portatore sano ha ereditato il gene da uno dei suoi genitori, quel genitore a sua volta dal proprio genitore, anche se non ci sono stati precedenti casi di malattia in famiglia: il gene può rimanere “silente” per generazioni fino a che non si verifica l’incontro del tutto casuale di due soggetti entrambi portatori. Due genitori portatori sani (asintomatici) avranno una probabilità del 25% di avere figli affetti da Fibrosi Cistica. Dalla stessa unione i figli avranno una probabilità su due (50%) di nascere portatori sani, come i genitori; una probabilità del 25% di avere figli né portatori, né malati. Il gene CFTR produce una proteina che regola il trasporto di sali attraverso la membrana cellulare; una mutazione causa la produzione di una proteina anomala che non funzionando al meglio, altera la composizione salina delle secrezioni ghiandolari, che assumono una consistenza densa e viscosa.

Test genetico
L’unico modo per identificare i portatori sani è quello di effettuare un test sul DNA alla ricerca di mutazioni nel gene CFTR. L’analisi però è complicata dal fatto che esistono oltre 2000 mutazioni. Generalmente, il test genetico (indagine di primo livello) permette di identificare il 77-80% delle mutazioni, scelte fra le più frequenti nell’area geografica di interesse. Nella popolazione la mutazione più frequente è la F508del (51% in Italia). A seguito dell’analisi genetica per fibrosi cistica, sul DNA del paziente, si possono ottenere tre tipi di risultati:
• presenza di una mutazione a livello di una copia del gene CFTR, mentre l’altra copia è normale. Si dice che il soggetto risulta eterozigote per quella mutazione, e significa che è un portatore sano, asintomatico
• presenza di mutazioni in entrambe le copie del gene CFTR. Si dice che il soggetto è eterozigote composto se le due sono mutazioni diverse o omozigote se le due mutazioni sono uguali e significa che il paziente è affetto da fibrosi cistica
• assenza di mutazioni del gene CFTR. Questo risultato “negativo” per le mutazioni ricercate significa che il soggetto ha una probabilità diminuita, rispetto a prima dell’analisi, di essere un portatore. Il test genetico non esclude in assoluto la probabilità di essere un portatore, perchè non è possibile escludere la presenza di un’altra delle numerosissime mutazioni del gene della fibrosi cistica, non comprese nel pannello delle mutazioni indagate
E’ importante però ricordare che:
• la probabilità di essere un portatore di fibrosi cistica è maggiore per un soggetto che sia parente di un malato o di un portatore. In questo caso è necessario prima identificare la mutazione del malato o del portatore presente in famiglia (mutazione “familiare”) e poi ricercarla nel parente. Se il parente risulta non avere nel suo DNA la mutazione familiare, la sua probabilità di essere portatore diventa estremamente bassa
• la probabilità di essere portatore di fibrosi cistica è minore nel soggetto che non è parente di un malato o di un portatore. In questo caso, chi si sottopone alla ricerca delle più frequenti mutazioni del gene della fibrosi cistica e risulta negativo, ha una probabilità di essere portatore molto bassa, anche se non zero
In casi particolari può essere eseguito anche un test genetico che prevede l'analisi di mutazione dell'intero gene (indagine di II° livello), con conseguente ricerca di tutte le mutazioni sinora scoperte. Il sequenziamento del gene CFTR non è in grado di escludere al 100% la probabilità di essere portatore. Nessun test di laboratorio fra quelli in uso nella pratica medica ha una “certezza” del 100% di escludere lo sato di portatore o di identificazione della mutazione
L’ indagine di III° livello mira a scoprire le mutazioni non identificate dalle indagini di primo e secondo livello

Polimorfismo IVS8-poly-T
In una regione del gene CFTR, chiamata introne 8, si trova una breve sequenza costituita dalla successione della base azotata timina (T) definita poly-T. Il numero di T regola il processo di maturazione di RNA messaggero e quindi la produzione di proteina CFTR ed è soggetto a variabilità individuale, per cui si parla di polimorfismo. La T può essere ripetuta 5, 7 o 9 volte. E’ ben noto che il numero di ripetizioni del tratto T condiziona il buon funzionamento del gene e quindi la produzione di una quantità normale di proteina CFTR. Da studi effettuati, si è potuto stabilire che il poly-T 5T è associato ad una ridotta produzione della quantità di proteina. La presenza del poly-T 5T e di una mutazione del gene CFT R può essere causa di forme atipiche di fibrosi cistica, ad esempio nei maschi agenesia mono o bilaterale dei vasi deferenti (CAVD) e conseguente sterilità.

Consulenza genetica
La Consulenza Genetica fornisce ai pazienti e i loro familiari, in termini comprensibili, informazioni sul rischio di trasmissione della malattia all’interno della famiglia, sulle possibilità di diagnosi e trattamento pre e postnatale.
Tempi di risposta
Il risultato dell’analisi (test genetico di I livello, 50 mutazioni) è disponibile dopo 7 giorni lavorativi dal prelievo.
E’ possibile eseguire il sequenziamento della regione codificante dell’intero gene CFTR.
Materiale analizzato
DNA estratto da linfociti di sangue periferico mediante prelievo venoso raccolto in provette con EDTA.

Fonti bibliografiche e sitografiche
Malattie genetiche – Cao, Dalla Piccola, Notarangelo – Piccin (2004)
Genetica medica essenziale – Dalla Piccola, Novelli – Il Minotauro (2006)
www.orpha.net
www.genet.sickkids.on.ca/cftr

5Emocromatosi classica o Tipo 1

Aspetti clinici

L'emocromatosi è una malattia ereditaria determinata da difetti nei meccanismi di regolazione del metabolismo del ferro che conducono al progressivo accumulo di esso nell'organismo. Oggi si riconoscono 4 tipi di emocromatosi dovuti a difetti di 5 diversi geni: HFE (tipo 1), HFE2 (tipo 2a), HAMP (tipo 2b), TFR2 (tipo 3) e SLC40A1 (tipo 4 o ferroportinopatia). Le emocromatosi, tranne quella di tipo 4, sono malattie a trasmissione autosomica recessiva. Per essere malato occorre avere ereditato il difetto genetico da entrambi i genitori (stato di omozigosi). Entrambi i genitori hanno un solo gene anomalo (stato di eterozigosi) e non sviluppano un sovraccarico di ferro. Il portatore può essere identificato con certezza solo attraverso lo studio delle famiglie dei malati. L'emocromatosi di tipo 4 è invece a trasmissione autosomica dominante, in questo caso basta un genitore affetto che può trasmettere la malattia ai figli.

La forma più frequente di emocromatosi è l’Emocromatosi Classica o di tipo 1. La sua frequenza è variabile: interessa 1 su 300 persone nel Nord Europa e circa 1 su 1.000 in Italia. L’emocromatosi classica o Tipo 1 è una patologia caratterizzata da un eccessivo assorbimento intestinale di ferro che tende ad accumularsi inizialmente a livello epatico e successivamente ad altri organi. Il ferro (Fig.1) introdotto con gli alimenti viene assorbito a livello intestinale, prevalentemente nel duodeno, passa nel circolo sanguigno dove si lega alla transferrina (Tf) che lo trasporta o al fegato per essere depositato come ferritina o agli organi che lo utilizzano (muscoli, midollo osseo,…). Il midollo produce i globuli rossi (GR) che incorporano il ferro, indispensabile per la funzione di trasporto di ossigeno; i globuli rossi invecchiati vengono demoliti nella milza e liberano il ferro che torna nel circolo sanguigno per essere riutilizzato. L’eccesso di ferro è causa di danni al fegato (cirrosi epatica talvolta complicata da epatocarcinoma), cardiopatie, diabete mellito, artropatie, osteoporosi, ipogonadismo ipogonadotropo, affaticamento cronico, iperpigmentazione cutanea. Le anomalie biochimiche comprendono l’aumento del ferro sierico, del coefficiente di saturazione della transferrina e dei livelli di ferritina sierica. L’età di esordio della malattia varia dai 30 ai 50 anni e le manifestazioni cliniche sono più frequenti nei maschi, poiché nelle donne il ferro in eccesso viene eliminato tramite il flusso mestruale o la gravidanza.

La terapia per rimuovere il ferro in eccesso consiste nella rimozione di sangue tramite salasso in quantità compresa tra i 350 e i 450 mL a seconda del peso individuale e con una frequenza variabile, settimanale nei casi più severi, quidicinale o anche mensile nelle forme più lievi. Casi particolari richiedono approcci terapeutici più complessi che vanno definiti nei centri specializzati. L’alimentazione può aiutare a ridurre il sovraccarico di ferro, di solito è indicata una dieta equilibrata nella quantità, nella composizione (rapporti corretti tra carboidrati, grassi e proteine) e nella qualità dei cibi. Sebbene non vi siano evidenze scientifiche, un elevato contenuto di carne nella dieta può facilitare lo sviluppo di un più grave sovraccarico di ferro oltre a favorire alterazioni metaboliche per il contenuto di grassi e proteine. Vino e superalcolici sono da evitare o da assumere in modo occasionale.

Aspetti genetici

L’emocromatosi di tipo 1 è una malattia monogenica che si trasmette con modalità autosomica recessiva, causata da mutazioni, cioè alterazioni del DNA, che insorgono nel gene HFE, localizzato sul cromosoma 6. Il gene HFE codifica per una proteina che rappresenta il “sensore” del ferro; in condizioni normali la proteina si trova sulla superficie delle cellule del tratto intestinale e grazie alla sua funzione di sensore regola l’assorbimento di ferro. La mutazione più frequente del gene HFE, nota come C282Y, determina la produzione di una proteina alterata che non si esprime sulla superficie delle cellule intestinali che quindi in assenza del “sensore” sono predisposti ad assorbire una maggiore quantità di ferro. Un’altra mutazione (H63D) permette alla proteina di esprimersi sulla superficie delle cellule dell’intestino ma non di svolgere la funzione di sensore, portando così ad un sovraccarico di ferro. Nella popolazione generale il 60-90% dei pazienti (64% in Italia con gradiente descrescente da Nord a Sud) con emocromatosi classica è omozigote per la mutazione C282Y, il 5% eterozigote composto C282Y/H63D con manifestazioni cliniche meno gravi e l’1-2% omozigote per H63D che sviluppa sovraccarico di ferro solo in associazione con altri fattori di rischio. Recentemente è stata riscontrata un’altra mutazione (S65C) che quando è ereditata con la C282Y o la H63D, sembra associata ad un moderato accumulo di ferro e quindi un aumentato rischio di sviluppare una forma lieve di emocromatosi.

Test genetico
Il test genetico identifica le tre principali mutazioni del gene HFE, C282Y, H63D e S65C e consente inoltre di individuare il genotipo HFE, ovvero di definire per ciascuna delle tre mutazioni se il paziente che si sottopone al test è omozigote normale o mutato, eterozigote (portatore sano), eterozigote composto

Tempi di risposta
Il risultato del test sul DNA per la ricerca delle mutazioni nel gene HFE è disponibile dopo 10 giorni dal prelievo

Consulenza genetica
La consulenza genetica darà informazioni ai pazienti e i loro familiari, in termini comprensibili sul rischio di trasmissione della malattia all’interno della famiglia, sulle possibilità di diagnosi e trattamento.
Materiale analizzato
DNA estratto da linfociti di sangue periferico mediante prelievo venoso raccolto in provette con EDTA.

Fonti bibliografiche e sitografiche
Malattie genetiche – Cao, Dalla Piccola, Notarangelo – Piccin (2004)
www.orpha.net
www.emocromatosi.it

6Microdelezioni del cromosoma Y

Aspetti generali
La formazione e maturazione degli spermatozoi (spermatogenesi) è un processo complesso che avviene sotto il controllo di diversi geni, situati nella regione AZF (AZoospermia Factor) del braccio lungo del cromosoma Y. La regione AZF è suddivisa in tre subregioni, definite AZFa, AZFb, AZFc, in cui sono distribuiti i geni coinvolti nella spermatogenesi.
La microdelezione, cioè la perdita di una o più subregioni non visibile con il cariotipo, è associata a sterilità maschile e rappresenta la causa più frequente di oligo/azoospermia non ostruttiva (10-15% dei casi).
La microdelezione più comune riguarda la regione AZFc (60-80% dei casi), seguita da AZFb (9-16%) e AZFa (3-5%); raramente possono mancare due regioni (AZFbc) o tutte e tre (AZFabc).

Test genetico
Il test consiste nell’amplificazione mediante tecnica PCR di sequenze specifiche, chiamate STS (Sequence-tagged site), distribuiti nelle tre subregioni AZF del cromosoma Y. Gli STS analizzati sono sY84 ed sY86 per la regione AZFa, sY127 ed sY134 per la regione AZFb, sY254 e sY255 per la subregione AZFc.
I prodotti di amplificazione vengono poi analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio.

Consulenza genetica
La Consulenza genetica fornisce informazioni ai pazienti, in termini comprensibili sulla patologia, diagnosi e trattamento Tempi di risposta
Il risultato mediamente è disponibile dopo 10 giorni dal prelievo

Materiale analizzato
DNA estratto da linfociti di sangue periferico (in provetta con EDTA) mediante prelievo venoso
Fonti sitografiche
http://www.sidr.it/
http://www.orpha.net